1. BCA法測定試劑盒
堿性條件下,蛋白將Cu2+還原為Cu+, Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物,測定其在562nm處的吸收值,并與標準曲線對比,即可計算待測蛋白的濃度。不方便的是這種方法需要提前制作標準曲線。BCA蛋白質(zhì)測定方法靈敏度高,操作簡單,試劑及其形成的顏色復合物穩(wěn)定性俱佳。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質(zhì)濃度檢測,可兼容高達5%的SDS,TritonX-100及Tween等。然而,由于BCA方法依靠銅離子進行顯色反應,如果溶液中含有與銅離子反應的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、β-巰基乙醇,結(jié)果將受到很大程度的影響。同時,BCA方法的檢測結(jié)果也會受到蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸,酪氨酸,色氨酸含量的影響。
2. Bradford法
該方法的原理是,帶負電的考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用。考馬斯亮藍在溶液中顯紅色,吸收峰在465nm處,當與蛋白質(zhì)結(jié)合后,其顯藍色,在595nm處有吸收峰。595nm處的吸光值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比。
Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質(zhì)的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達1M,二硫蘇糖醇的濃度可高達5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%,Triton X-100低于0.1%,Tween 20, 60, 80低于0.06%。
3. UV280法
這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
1)簡易經(jīng)驗公式
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
2)精確計算
通過計算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通過如下公式計算最終結(jié)果:
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d為測定OD值比色杯的厚度
D為溶液的稀釋倍數(shù)
4. Lowry法
蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合,形成蛋白質(zhì)一銅復合物,此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原,產(chǎn)生藍色化合 物,在一定條件下,利用藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標準曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。
5、考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)法
考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度,是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理,定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。
考馬斯亮藍G―250存在著兩種不同的顏色形式,紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合,在一定蛋白質(zhì)濃度范圍 內(nèi),蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律(Beer’s law)。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍色形式,最大光 吸收由465nm變成595nm,通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。
蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程,約2min即可反應*,呈現(xiàn)最大光吸收,并可穩(wěn)定1h,之后,蛋白質(zhì)―染料復 合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)―染料復合物具有很高的消光系數(shù),使得在測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高,在測定 溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時就有0.275光吸收值的變化,比Lowry法靈敏4倍,測定范圍為10-100µg蛋白質(zhì),微量測定 法測定范圍是1-10µg蛋白質(zhì)。此反應重復性好,精確度高,線性關(guān)系好。標準曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時稍有彎曲, 這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊,試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低,但直線彎曲程度很 輕,不影響測定。
此方法干擾物少,研究表明:NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4無干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色 干擾,這可以用適當?shù)木彌_液對照扣除其影響。Tris,乙酸,2―巰基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污劑如 Triton X―100,SDS,玻璃去污劑有少量顏色干擾,用適當?shù)木彌_液對照很容易除掉。但是,大量去污劑的存在對 顏色影響太大而不易消除。